Blast如何选择数据库

当你在浩瀚的生物信息海洋中使用BLAST这把“探针”去寻找相似序列时，选对数据库是成功的关键第一步，选错了数据库，轻则效率低下、结果冗杂，重则可能得到完全错误或误导性的结论，浪费宝贵的研究时间和精力，本文将深入浅出地讲解如何为你的BLAST分析精准选择最合适的数据库，助你高效、准确地获取所需信息。

核心原则：明确你的分析目标

选择数据库的出发点,永远是你的核心问题：

1. 我手中的序列是什么类型？

   • DNA (核苷酸序列) – 如基因片段、ESTs、基因组草图。
   • Protein (蛋白质序列) – 如从DNA翻译得到的氨基酸序列、纯化的蛋白质序列。
   • ️ 特别注意：BLAST程序与数据库类型必须严格匹配！
     • blastn 用于查询核苷酸序列 vs 核苷酸数据库 (nt, refseq_rna, 16S…)
     • blastp 用于查询蛋白质序列 vs 蛋白质数据库 (nr, refseq_protein, swissprot…)
     • blastx 用于查询核苷酸序列（翻译成蛋白质） vs 蛋白质数据库 (常用于分析未鉴定DNA序列的功能)
     • tblastn 用于查询蛋白质序列 vs 核苷酸数据库（翻译成蛋白质）(常用于在基因组或EST中寻找同源基因)
     • tblastx 用于查询核苷酸序列（翻译成蛋白质） vs 核苷酸数据库（翻译成蛋白质）(计算量大，通常用于远缘关系)

2. 我想解决什么问题？

   • 鉴定一个未知序列：它是哪个物种的？是什么基因或蛋白？（通用数据库如 nr/nt，或更精准的 RefSeq）
   • 寻找直系同源物（Orthologs）：跨物种的相同功能基因？（高质量注释数据库如 RefSeq 或 Swiss-Prot）
   • 分析物种分类：如基于16S rRNA基因确定微生物分类？（专用数据库如 16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea)）
   • 研究特定功能域或家族：这个蛋白属于哪个家族？有什么结构域？（专用数据库如 Conserved Domains Database (CDD), Pfam）
   • 宏基因组或宏转录组分析：环境样本中的微生物组成？（专用数据库或精心构建的参考数据库）
   • 检查序列的独特性/是否存在被墙物：我的序列是新的吗？有没有载体被墙？（专用数据库如 vector）
   • 比较我的序列与某个特定基因组：这个基因在目标物种基因组中的位置？（该物种的基因组数据库 .fna， .faa 或 refseq_genomes 按物种选择）
   • 寻找可能的引物结合位点或非特异性结合？（nr/nt，但需注意结果解读）

下表总结了常见分析目标与推荐的数据库选择：

主流公共数据库详解 (以NCBI为例)

NCBI BLAST 提供了丰富的公共数据库，理解它们的构成和特点至关重要：

1. nr (非冗余蛋白质数据库 – Non-redundant Protein):

   • 合并了 GenBank, RefSeq, PDB, Swiss-Prot, PIR, PRF 等来源的蛋白质序列，并去除严格相同（100% 一致）的序列，注意，它不是完全去冗余的，不同来源的、非100%相同的同源序列（如来自不同物种的同源蛋白，或同一蛋白的不同亚型）都会被保留。
   • 优点: 覆盖范围最广，包含来自大量物种的预测和已注释的蛋白质，是进行未知蛋白质功能注释、寻找远缘同源物最常用的起点。
   • 缺点: 非常庞大，搜索耗时较长，结果中可能包含大量冗余信息（如来自不同测序项目的同一蛋白质预测）、低质量的预测序列、错误注释，需要仔细甄别结果。
   • 何时用: 查询未知蛋白质序列；进行广泛的同源性搜索（特别是远缘物种）；不介意结果中包含较多预测序列和潜在冗余。

2. nt (非冗余核苷酸数据库 – Non-redundant Nucleotide):

   • 类似于 nr，是 GenBank, RefSeq, EMBL, DDBJ, PDB 等来源的核苷酸序列（主要是编码区CDS, EST, GSS, STS, 非编码RNA等）的部分去冗余（去除严格相同序列）集合。
   • 优点: 覆盖范围广。
   • 缺点: 庞大、包含冗余（如不同来源的同基因记录）、预测序列、错误注释，包含大量非基因序列（ESTs等）。
   • 何时用: 查询未知DNA序列（使用blastn）；检查序列是否新颖（但需结合其他证据）；寻找可能的同源基因（注意区分编码区和非编码区结果）。

3. RefSeq 参考序列数据库 (Reference Sequence Database):

   • NCBI精心策划的、高质量、非冗余的参考序列集合，包含基因组（refseq_genomes）、转录本（refseq_rna）、蛋白质（refseq_protein）等子集。“非冗余”程度远高于 nr/nt，它整合了来自同一基因座（locus）的最佳代表序列，去除了冗余的提交版本。
   • 优点: 注释质量高、可靠性强、冗余度低，是进行物种间比较、寻找可靠直系同源物、获取标准基因/蛋白信息的首选，数据库按物种或分类群组织清晰（如refseq_select, refseq_vertebrate_mammalian, refseq_protein_vertebrates）。
   • 缺点: 覆盖的物种数量不如 nr/nt 全面，主要集中于模式生物和有较好基因组注释的物种。
   • 何时用:
     • refseq_rna: 精确鉴定基因/转录本（blastn）、物种分类（如使用特定基因）。
     • refseq_protein: 精确鉴定蛋白质、寻找直系同源物（blastp, blastx）、功能注释。
     • refseq_genomes (或特定物种基因组): 将查询序列定位到特定物种基因组（blastn, tblastn）或比较蛋白质组（tblastn）。
     • refseq_select: 包含每个蛋白编码基因的一个代表性转录本（及其蛋白产物），适合快速、去冗余的分析。

4. 其他重要专用数据库:

   • 16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea): 专门用于通过16S rRNA基因序列进行细菌和古菌的物种鉴定和分类学分析（blastn），结果通常包含分类学信息。
   • 18S ribosomal RNA sequences (eukaryotes): 类似16S，用于真核生物（特别是原生生物、真菌）的分类（blastn）。
   • ITS (Internal Transcribed Spacer) for Fungi: 用于真菌物种鉴定的核心条形码区域（blastn）。
   • COX1 (cytochrome c oxidase subunit I): 动物（特别是无脊椎动物）DNA条形码分析（blastn）。
   • Conserved Domains Database (CDD): 包含保守蛋白质结构域和功能位点的序列模型（使用rpsblast程序），用于分析蛋白质的功能域组成。
   • Swiss-Prot (通过UniProtKB): 另一个高质量、人工注释的蛋白质数据库，注释非常详尽可靠（通常比RefSeq_protein更深入）。寻找直系同源物、功能研究的极佳选择（blastp），在NCBI BLAST中，其精选部分包含在 nr 中，但有时通过UniProt网站直接使用更佳。
   • vector / UniVec: 包含常见的测序载体、接头、引物序列，用于检查实验序列中是否存在载体被墙（blastn）。
   • Betacoronavirus / 其他特定病原体数据库: NCBI或研究者构建的特定病原体（如SARS-CoV-2）基因组/蛋白数据库，用于追踪变异、诊断等。
   • Patent sequences: 包含专利中的序列。

🧭 实用选择策略指南

1. 根据生物类型和问题快速定位:

   • 细菌/古菌未知基因或物种鉴定？ 首选 blastn vs 16S ribosomal RNA (如果查询是16S) 或 blastx vs nr / refseq_protein (如果查询是未知DNA)。
   • 真核生物（非真菌）基因/转录本鉴定？ blastn vs refseq_rna (首选) 或 nt (更广但杂) 或 blastp/blastx vs refseq_protein/nr (如果已知是蛋白编码)。
   • 真菌物种鉴定？ blastn vs ITS (首选) 或 18S / 28S。
   • 动物（尤其无脊椎）物种鉴定（DNA条形码）？ blastn vs COX1 (首选)。
   • 未知蛋白质功能预测/同源物搜索？ 首选 blastp vs refseq_protein (高质量去冗余) 或 nr (最广泛覆盖)，追求最高注释质量可用blastp vs Swiss-Prot (通过UniProt)。
   • 分析蛋白质包含哪些功能域？ 使用 rpsblast vs CDD。
   • 我的DNA序列是否编码蛋白？可能是什么？ 使用 blastx vs refseq_protein (首选) 或 nr。
   • 在特定物种（如人类、小鼠）基因组中找同源基因？ tblastn vs 该物种的基因组数据库 (如 Human genomic + transcript, Mouse genomic + transcript 在 refseq_genomes 下) 或 blastp vs 该物种的蛋白质数据库 (如 Human Proteins, Mouse Proteins 在 refseq_select 或 refseq_protein 下)。
   • 检查测序序列是否有载体被墙？ blastn vs vector / UniVec。

2. 平衡“广覆盖”与“高质量、低冗余”:

   • 初次探索未知序列,想了解最广泛的同源信息? 考虑 nr (蛋白) 或 nt (核酸)，但要做好筛选冗余结果的准备。
   • 追求可靠结果、物种间比较、标准参考? 首选对应的 RefSeq 数据库 (refseq_protein, refseq_rna)。
   • 需要最精准的蛋白功能注释? 首选 Swiss-Prot (通过UniProt)。

3. 考虑数据库大小和搜索速度:

   • RefSeq 通常比 nr/nt 小得多，搜索更快。Swiss-Prot 更小。
   • 专用数据库（如16S, ITS, CDD）非常快速。
   • 宏基因组分析警告： 避免直接 blastn vs nt！它巨大且包含了大量与宏基因组无关的真核序列（如人类、小鼠），应使用针对宏基因组优化的数据库（如refseq_genomes 选择特定微生物类群构建本地库，或专门的宏基因组数据库如MGnify）。

4. 不可忽视的细节:

   • 数据库版本时效性: 公共数据库不断更新，了解你使用的数据库构建日期，特别是追踪快速进化的病原体（如流感干扰、SARS-CoV-2）或需要最新注释时，NCBI BLAST页面通常会显示数据库日期。
   • 序列方向性: blastn 默认搜索双链（会考虑查询序列的正反互补链），如果你确定查询序列的方向（如已知是mRNA的正义链），可以使用 -strand 参数限制（通常不建议初学者使用）。
   • 覆盖度: 确保你关心的类群在所选数据库中有良好覆盖，RefSeq 对模式生物和常见物种覆盖好，但对极冷门的物种可能不如 nr/nt。
   • 自定义数据库: 如果你的研究聚焦于特定物种群或私有数据，构建本地自定义数据库是最高效、最精准的选择（使用makeblastdb命令）。

️ 总结与安全提示

• 匹配程序类型！ (blastn->核酸库, blastp->蛋白库, etc.) 这是最基本也最容易出错的一步。
• 明确你的目标！ 是鉴定、找同源物、查结构域、分类、还是去被墙？目标决定方向。
• 首选 RefSeq 系列数据库 (refseq_rna, refseq_protein) 进行高质量的基因/蛋白鉴定和同源物搜索，它们通常是最佳平衡点（质量、可靠性、去冗余度、速度）。
• 需要最广泛覆盖或搜索远缘同源物？ 考虑 nr (蛋白) / nt (核酸)，但谨慎解读结果。
• 追求最高蛋白注释质量？ 使用 Swiss-Prot (通过UniProt网站)。
• 分类学分析（微生物）？ 使用专用数据库 (16S, ITS, COX1)。
• 功能域分析？ 使用 rpsblast + CDD。
• 检查被墙？ 使用 vector/UniVec。
• 针对特定物种？ 优先使用该物种的 RefSeq 基因组或蛋白质组数据库。
• 宏基因组？ 避免直接 nt！使用针对性数据库。
• 留意数据库日期和覆盖度！
• 重要数据安全提示： 在上传包含个人基因组信息、患者数据或未发表的敏感序列到任何公共BLAST服务器（如NCBI BLAST）前，务必确认该平台的数据使用政策和隐私条款，公共服务器通常会将查询序列存储在日志中一段时间，并可能用于改进服务，对于高度敏感的数据，强烈建议使用本地安装的BLAST+软件和本地数据库进行分析，以完全掌控数据安全。

掌握数据库选择的艺术,能让你的BLAST之旅事半功倍，直达有价值的生物学洞见！

引用说明：

• 本文中关于数据库描述（nr, nt, RefSeq, 16S, CDD 等）、程序功能 (blastn, blastp, blastx, tblastn, rpsblast)、以及核心选择原则的阐述，主要基于 NCBI BLAST 官方文档、帮助页面和数据库描述信息，这些是最权威的来源。
• NCBI Resource Coordinators. (2025). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research, 52(D1), D33–D43. (概述了包括BLAST所用数据库在内的所有NCBI资源)
• Johnson, M., et al. (2008). NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research, 36(Web Server issue), W5–W9. (介绍了NCBI Web BLAST的界面和特性，隐含了数据库选择选项)
• 对于 Swiss-Prot 的描述，参考了 UniProt Consortium 的官方文档和网站信息： The UniProt Consortium. (2025). UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Research, 51(D1), D523–D531.
• 宏基因组分析的建议参考了相关领域的最佳实践综述, Meyer, F., et al. (2019). Critical Assessment of Metagenome Interpretation: the second round of challenges. Nature Methods, 16(8), 603–606. (强调了针对性数据库的重要性)
• 安全提示依据 NCBI BLAST 网站使用条款和数据隐私声明 (请在使用时查阅NCBI官网最新版)。